2001年,主演了表现广西桐乡文化的电视轻喜剧《都市山歌》,该剧以音乐舞蹈为表现形式,她在剧中饰演淳朴美丽侗乡的姑娘宝妮。
2002年,首次出演古装剧《浪迹天涯》,该剧讲述了江南才子秦涧泉游历天下、仗义行侠的故事,而她则饰演了性格豪爽的温柔,与秦涧泉互有好感;随后,在黄海冰、宁静、张静初主演的历史武侠剧《英雄》中饰演靖南王郡主朱芷菁;还与张智霖、朱茵合作出演古装武侠剧《如来神掌》,扮演柳中原独女柳明鸾,活泼可人,对欧敬豪死心塌地。
2003年,出演了陆毅、林心如主演的都市情感剧《男才女貌》。
2004年,她出演了讲述花样游泳队的都市情感剧《出水芙蓉》,在剧中饰演上海体院花样游泳队队员叶佳,聪颖美丽但却自负的女孩;接着又在以太极拳为题材的古装剧《太极英雄》中饰演名满苏杭的头号美人谈侃侃;同年,出演了由孙兴及崔智友主演、翻拍自1991年纯爱日剧《101次求婚》的电视剧《第101次求婚》。
2006年,在张家辉、蔡琳主演的古装剧爱情轻喜剧《新醉打金枝》中饰演升平公主的贴身侍女剑眉;同年,与胡歌、何润东等人合作出演古装剧《少年杨家将》,饰演辽朝萧太后之女耶律琼娥,晋封“银镜公主”,最终嫁给失忆的四郎杨延辉。
2007年,出演范冰冰、马景涛主演的古装神话电视剧《封神榜之凤鸣岐山》,在剧中饰演妲己的姐妹“琵琶精”胡喜媚;还与张智尧、张智霖共同出演了央视电影频道出品的数字电影《陆小凤传奇之大金鹏王》。
2015年3月,参演复出后的首部电视剧《御姐归来》,她在这部由安以轩、朱一龙主演的都市情感轻喜剧中饰演富家女胡娜。11月,在职场情感剧《北上广不相信眼泪》中饰演“微信女孩”妙妙,戏份不多却引人关注。同时还受邀加盟浙江卫视《我不是明星》节目,成为该节目的新晋选手,首次登台的她在节目中表演了各种舞蹈。参演电影《情定河州》。
2019年9月9日,参演青春校园情感剧《我在未来等你》,饰演有过留学经验的英语老师MISSYANG。
2006年2月,吴佳尼与台湾男演员马景涛在拍摄电视剧《封神榜之凤鸣岐山》时日久生情,同年4月相恋,6月26日在上海订婚。
2007年2月14日,在情人节同时也是马景涛生日当天,吴佳尼与马景涛在上海注册结婚,吴佳尼是马景涛的第二任妻子,比马景涛小21岁,此时她已怀有身孕。6月6日中午,吴佳尼顺利产下一子,取名为马世天。
2009年2月2日,吴佳尼生下第二个儿子马世心。
2015年11月,马景涛与吴佳尼在节目《我不是明星》补办婚礼,夫妻俩甜蜜接吻,相拥而泣。两个帅气的儿子也当起了小花童,一家幸福美满。
2017年3月30日,马景涛在微博发了一篇题为《十年一觉愚公梦》的长文,在文中宣布结束10年婚姻,与吴佳尼离婚。