1949年,担任中国人民解放军济南市职工学校文化干事。1950年,先后担任济南警备政治部文工团、步兵九十七师文工队、山东军区政治部文工团演员。1955年,担任山东省话剧团的演员。
1959年,参演个人首部电影《敢想敢做的人》。1964年,与郭殿昌等共同主演剧情电影《丰收之后》。1978年,出演由傅超武、高正联合执导的剧情电影《平鹰坟》。
1981年,与王书勤、温玉娟联袂主演喜剧电影《喜盈门》,在片中饰演性格贤惠善良、慈祥的仁文妈妈,她凭借该片入围第2届中国电影金鸡奖最佳女配角奖。1982年,与倪萍等联合出演剧情电影《山菊花》。1983年,与高保成共同主演剧情电影《内当家》。
1984年,与吕晓禾、唐国强联合出演剧情电影《高山下的花环》,她凭借该片获得第8届电影百花奖最佳女配角奖、第4届中国电视剧飞天奖最佳女配角奖;同年,在传记电影《谭嗣同》中饰演慈禧太后,她凭借该片获得第5届中国电影金鸡奖最佳女配角奖;此外,还参演了剧情电影《欧妹》。1987年,王玉梅获得新时期十年电影演员荣誉奖。
1989年,由其出演的剧情电影《一代枪王》上映。1991年,与朱旭、费洋联合主演剧情电影《心香》,她凭借该片入围第12届中国电影金鸡奖最佳女配角奖。1992年,与赵秀丽合作主演的电视剧《帅大姐》播出。1994年,与高明俊、王馥荔联袂出演剧情电影《五魁》。1995年,与剧雪、常戎联合主演剧情电影《童年的风筝》。
1996年,与奇梦石、奚美娟联袂主演家庭伦理剧《儿女情长》,在剧中饰演外表慈祥内心善良的母亲方秀云,她凭借该剧获得第15届中国电视金鹰奖最佳女主角奖、第18届中国电视剧飞天奖优秀女演员奖。1997年,与王星军共同主演剧情电影《丝绸之路》;同年,与奥登高娃等联合主演传记电影《张骞》。
1999年,与薛佳凝合作主演剧情电影《人见人爱》。2000年,与田成仁、何冰联合主演剧情电影《金婚》。2001年,与王兰合作主演剧情电影《情归天尽头》。2003年,与赵静共同主演电视剧《撑起生命的蓝天》,该剧以中国首届“十大杰出母亲”沈利萍和其子王嘉鹏的真实故事改编。
2008年,与杨立新合作主演古装剧《漕运码头》,在剧中饰演爱新觉罗·铁麟的奶妈孙嬷嬷。2009年,在周晓文执导的家庭剧《晚婚》中饰演王秀英;同年,与王雅捷联合出演青春励志电影《舞蹈系》,在片中饰演老年时期的福才家;此外,还参演了古装剧《新包青天之七侠五义》。
2012年,与孙勇波共同主演戏曲电影《槐花几时开》。
王玉梅虽然相貌普通,但她热情、勤奋、朝气蓬勃。在电影《丰收之后》中,她塑造的赵五婶朴实纯正,坚韧刚强,贤淑宽厚,既含着齐鲁大地的山野气息,又闪烁着共产党人的理想光芒,还具备着中国劳动妇女的传统美德。演出时,她与角色融为一体,达到了“如鱼得水,游刃自如”的艺术境界。她在表演创作过程中,一贯注意从生活出发,平时就有着丰富的生活积累,一旦需要,她又善于调用、融化、参透这些生活积累于角色塑造中去。她多年的话剧舞台实践,使她注重并具备了从整体上把握角色的动力,能够很快地形成角色完整而连贯的心像。